Determinação de SOD em crianças com Doença Falciforme (extraída de BISWAL et al, 2019)

Título do artigo original: Oxidative stress, antioxidant capacity, biomolecule damage, and inflammation symptoms of sickle cell disease in children

Autores: Sebaranjan Biswal, Huma Rizwan, Sweta Pal, Silpa Sabnam, Preetinanda Parida, and Arttatrana Pal

Ano de publicação: 2019

DOI: https://doi.org/10.1080/10245332.2018.1498441

Número de citações: 13

Fator de Impacto: 2.269 (2020)

Resumo traduzido e retirado do artigo:

Visão geral: A expressão fenotípica da doença falciforme (DF) é uma condição fisiopatológica complexa. No entanto, os eritrócitos falciformes podem ser a causa de múltiplas fontes de processos pró-oxidantes com consequentes vínculo ao estresse oxidativo crônico e sistêmico. Aqui, exploramos o fenômeno da DF que pode resultar na formação de estresse oxidativo, bem como na inflamação em crianças.

Material e métodos: Amostras de sangue de 147 indivíduos com DF foram avaliadas. Um grupo controle foi formado por 156 indivíduos sem DF. Diferentes marcadores de estresse oxidativo e mediadores inflamatórios foram medidos usando várias técnicas bioquímicas. Amostras de plasma foram coletadas de sangue para dosagem de antioxidantes e espécies reativas de oxigênio (ROS).

Resultados: Os níveis plasmáticos de radical hidroxila (HO •) e produção de óxido nítrico (NO) foram maiores em crianças com DF em comparação aos grupos de controle. As capacidades antioxidantes plasmáticas, como superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa (GSH), glutationa peroxidase (GPx) e níveis de proteína tiol foram significativamente reduzidas em crianças com DF. A peroxidação de lipídios plasmáticos, carbonilação de proteínas e marcadores de danos ao DNA foram significativamente alterados em diferentes grupos de idade de crianças com DF. Além disso, nossos resultados mostraram que crianças com DF apresentam doença inflamatória crônica devido à alteração persistente do conteúdo de hemoglobina, reticulócitos, bilirrubina total, plaquetas, creatinina, leucócitos e expressão alterada de mediadores inflamatórios em comparação aos grupos controle.

Conclusão: Crianças com DF apresentam alto estresse oxidativo e, inversamente, diminuição da atividade antioxidante. A diminuição da atividade antioxidante pode explicar a redução da peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e aumento da inflamação, que por sua vez intensificam os sintomas da DF em crianças.

Metodologia relacionada a Superóxido Dismutase (SOD) (BISWAL et al, 2019):

Número de participantes: 147 crianças com DF e 156 crianças sem DF

• Medição de SOD

Quadro 1: Reagentes e equipamentos necessários para medição de SOD

80 µg de proteínas plasmáticas foram misturados com 1,4 ml da mistura de reação (tampão Tris, L-metionina, Triton X-100, cloridrato de hidroxilamina, EDTA) e 80 µl de Riboflavina. Posteriormente, 1 ml do reagente de Griess foi adicionado à mistura e a absorbância foi registrada a 540 nm, de acordo com Kumar e colaboradores (2017). A atividade SOD foi expressa em unidades por miligrama de proteína (U / mg).

• Expressão de mRNA de MnSOD mitocondrial e CuZnSOD citosólico

Quadro 2: Reagentes, materiais e equipamentos necessários para a expressão de mRNA do MnSOD e CuZnSOD.

Para a análise de western blot, 40 μg de amostra de proteína foram resolvidos em géis de poliacrilamida 12% Tris-glicina, transferidos para membranas de nitrocelulose e bloqueados em 5% de leite desnatado. As membranas foram incubadas durante a noite com os anticorpos primários a 4 ° C. Após lavagem com 1XPBST (solução salina tamponada com fosfato com Tween-20), as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) por 2 h e as bandas de proteína foram detectadas por quimioluminescência intensificada (ECLTM Além disso, Invitrogen, EUA). Para controle de carregamento, a mesma membrana foi sondada novamente com anticorpo anti-β-actina. Em seguida, para quantificar o nível de mRNA, o RNA total foi isolado usando Trizol (Sigma Aldrich, EUA) e o cDNA de fita dupla foi preparado usando o kit de síntese de cDNA Revert Aid (Thermo Scientific). A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada com o sistema CFX connect Real-Time (BIO-RAD, EUA), utilizando o kit KAPA SYBR® FAST qPCR (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, EUA). Os oligonucleotídeos usados ​​para qRT-PCR são fornecidos na 3. O método 2-ΔΔCT foi usado para quantificar os níveis relativos do mRNA do gene alvo.

Quadro 3: Genes utilizados em qPCR, adaptado de BISWAL et al, 2019.

Referência: 

BISWAL, Sebaranjan; RIZWAN, Huma; PAL, Sweta; SABNAM, Silpa; PARIDA, Preetinanda; PAL, Arttatrana. Oxidative stress, antioxidant capacity, biomolecule damage, and inflammation symptoms of sickle cell disease in children. Hematology, v. 24, n. 1, p. 1-9, 2019.

KUMAR, Premranjan; RAMAN, Thiagarajan; SWAIN, Mitali Madhusmita; MISHRA, Rangnath; PAL, Arttatrana. Hyperglycemia-Induced Oxidative-Nitrosative Stress Induces Inflammation and Neurodegeneration via Augmented Tuberous Sclerosis Complex-2 (TSC-2) Activation in Neuronal Cells. Mol. Neurobiol., v. 54, n. 1, p. 238-254, 2017.